一種見于苗族家系的導(dǎo)致顯性遺傳性β地中海貧血的新移碼突變的鑒定.pdf

1、β地中海貧血(βthalassemia，簡稱β地貧)[MIM141900]是世界上最常見的單基因遺傳病之一，β地貧的地理分布主要在全球的熱帶和亞熱帶瘧疾高發(fā)地區(qū)，包括北非、地中海地區(qū)、中東、印度次大陸、東南亞和中國南方。該病在我國南方高發(fā)區(qū)人群中基因攜帶者頻率為0.5-6％，其中，尤以廣西、廣東和海南三省(區(qū))為甚，這些地區(qū)人群中的重型β地貧(包括中間型地貧)的發(fā)生率估計為0.4‰。雖然β地貧在中國南方非常常見，但是不同地區(qū)和不同民族的

2、地貧突變譜有待進一步確定，特別是一些少見的導(dǎo)致β地貧的基因突變的鑒定。完善我國南方人群β地貧突變譜對于指導(dǎo)臨床診斷和遺傳咨詢，以及制訂有效的人群預(yù)防計劃有重要意義。 β地貧通常被認為是一種常染色體隱性遺傳性疾病，即β珠蛋白基因純合子或雙重雜合子才能導(dǎo)致發(fā)病。然而，由β珠蛋白基因突變雜合子導(dǎo)致的顯性遺傳性B地貧少見病例已經(jīng)在多個種族人群中發(fā)現(xiàn)，例如β地貧顯性突變在英國人，意大利人，法國人，捷克人，西班牙人，朝鮮人和同本人中均有報道

3、。顯性遺傳性β地貧主要是由β珠蛋白基因的移碼突變，錯義突變和無義突變所引起。目前已經(jīng)報道的突變共有40種。其中，有29種位于外顯子3，7種位于外顯子2，其余的位于外顯子1以及外顯子內(nèi)含子剪接區(qū)。顯性遺傳性β地貧的臨床表現(xiàn)變異很大，從輕微的臨床癥狀到輸血依賴的癥狀皆可以存在。 我們在貴州省β地貧突變篩查的過程中，在一個苗族家系中鑒定出了一個引起顯性遺傳性β地貧的新移碼突變-cd53(-T)，以及二個新的RFLP單倍型。在家系分析的

4、基礎(chǔ)上，通過實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，我們在mRNA水平上分析了這一新突變對基因轉(zhuǎn)錄效應(yīng)的影響。 材料與方法： 先證者是一名22歲的年輕女性，有典型的貧血面容，皮膚黃染，腹部觸診有肝臟腫大，沒有輸血史。先證者和她全部的家庭成員(53人，3代)均為世居于我國貴州省安順地區(qū)的苗族人。先證者的血常規(guī)檢查顯示有小細胞低色素貧血癥，Hb含量9.9g/dl，MCV及MCH減低，HbA2增高。利用反向點雜交技術(shù)篩查中國人已知的24

5、種β地貧點突變，未見陽性結(jié)果。在簽署知情同意書后，我們對先證者及其17位家庭成員進行了家系調(diào)查。在這17位家庭成員中，有6人是先證者的一級親屬，有11人是先證者的二級親屬。其余家庭成員由于各種原因沒有參與此次研究。 采用酚/氯仿法提取樣品的外周血基因組DNA。反向點雜交技術(shù)用于中國人已知的24種β地貧點突變的基因分型。Gap-PCR技術(shù)用于中國人已知的3種常見α地貧缺失突變(--SEA/，-α3.7/和-α4.2/)分析；反向點

6、雜交技術(shù)用于中國人已知的6種α地貧點突變(αcd30α/，αcd31α/，αcd59α/，αQSα/，αCSα/和αWSα/)的診斷。這9種突變占到已知中國人僅地貧突變的98％。 為了評價β地貧新突變對β珠蛋白基因表達水平的影響，我們設(shè)計了實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR實驗，采用基于雙標準曲線法的定量分析，我們對該家系的6名新突變攜帶者和6名正常人的mRNA進行了基因表達水平檢測。并應(yīng)用獨立樣本t檢驗來分析突變組和正常對照組之間，平均

7、mRNA相對含量的差異。 為了調(diào)查新突變的分子遺傳學背景，我們選擇了β珠蛋白基因簇上7個經(jīng)典的限制性酶切位點(即HincⅡ-5'ε，HindⅢ-Gγ，HindⅢ-Aγ，HincⅡ-ψβ，HincⅡ-3'ψβ，AvaⅡ-β和BamHI-3'β)，用于構(gòu)建基于PCR的β珠蛋白基因RFLP單倍型。 結(jié)果與討論： 通過PCR擴增先證者及其家系成員β珠蛋白基因全長片斷，并對PCR產(chǎn)物直接進行DNA序列測定分析，我們發(fā)現(xiàn)，在

8、先證者及其6個表型陽性的家庭成員中，均存在同一種突變-cd53(-T)。在PubMed上進行文獻檢索，以及查詢珠蛋白基因服務(wù)網(wǎng)站(http://globin.cse.psu.edu/)，均未發(fā)現(xiàn)此突變類型。證實此突變是世界首報的β地貧突變類型，也是中國人人群中第一次報道的顯性遺傳性β地貧病例。 通過觀察53人的家系圖譜，可見每一名β地貧患者的父母中，只有一方受累。而且中間型β地貧的癥狀出現(xiàn)于家系中的每一代。該家系譜特征符合常染色

9、體顯性遺傳傳遞方式。通過基因分析，該家系排除了合并中國人主要已知α地貧突變的可能性：實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析顯示病例組與對照組的β珠蛋白基因表達水平無顯著差異。 目前，全世界發(fā)現(xiàn)了40種可以引起顯性遺傳性β地貧基因突變。在分子水平上，其遺傳缺陷有如下4種類型：①錯義突變：②完整密碼子的缺失或插入；③無義突變；④產(chǎn)生帶有異常羧基端的延長或截短蛋白的移碼突變和異常剪切點突變。目前已報道4種位于β珠蛋白基因第二外顯子上的移碼突變可以引

10、起顯性遺傳性β地貧。這4種突變?yōu)椋篶d91(-T)，cd94(+TG)，cd100(-CTT，+TCTGAGAACTT)和cd104(-G)，分別導(dǎo)致含有156，156，158和156個氨基酸的延長的β珠蛋白變異體產(chǎn)生。由于cd53(-T)導(dǎo)致含有59個氨基酸的β珠蛋白變異體，所以這是第一個位于第二外顯子上的導(dǎo)致截短的β珠蛋白變異體并引起顯性遺傳性β地貧的移碼突變。 β珠蛋白基因cd53缺失堿基T，導(dǎo)致在其下游19bp處出現(xiàn)了一

11、個不成熟的終止密碼子(PTC)。大多數(shù)的無義突變和移碼突變可以觸發(fā)無義介導(dǎo)的mRNA降解(NMD)，來清除含有PTC的mRNA。然而，本研究提示該位于β珠蛋白基因第二外顯子的移碼突變并非通過顯著降低mRNA轉(zhuǎn)錄水平來引起疾病?？赡艿脑蚴恰癗MD抵抗”在發(fā)揮作用。如果突變與下游的AUG密碼子足夠接近的話，翻譯再起始的機制就能夠消除NMD的作用。這一理論已經(jīng)在磷酸丙糖異構(gòu)酶基因和β珠蛋白基因中進行過闡述。既然在密碼子73/74處也有一個A

12、UG，那么翻譯再起始的機制也就同樣可以解釋cd53(-T)的“NMD抵抗”作用。異常的β珠蛋白mRNA可以翻譯產(chǎn)生大量截短的β珠蛋白，它們和富余的α珠蛋白同時沉積在紅細胞內(nèi)，導(dǎo)致紅細胞的無效生成。這一機制可以解釋cd53(-T)突變攜帶者所表現(xiàn)出的中間型β地貧的表型。進一步的研究還需要闡明cd53(-T)突變產(chǎn)生的異常mRNA的穩(wěn)定性以及翻譯情況的分子生物學基礎(chǔ)。 苗族是中國的第四大少數(shù)民族，人口有894萬。其中有一半居住在貴州

13、省，其余分布在中國南方的幾個其他省份。由于歷史上苗民族的長期遷移，在越南，泰國，老撾，美國，加拿大，法國和澳大利亞，也有300多萬的人口分布。我國苗族的β地貧的攜帶者率仍在調(diào)查之中，本研究是首次在這一民族中發(fā)現(xiàn)新的β珠蛋白基因突變。因為大部分的苗族人口居住在地貧高發(fā)的地區(qū)，所以針對大量人口進行的地貧發(fā)病率和突變譜的研究，對以社區(qū)為基礎(chǔ)的地貧預(yù)防計劃的制訂有重要價值。除了新突變cd53(-T)，我們還鑒定出兩個新的β珠蛋白基因單倍型，即M