高分辨熔解曲線分析技術(shù)在地中海貧血基因診斷及產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、α地中海貧血（α-thalassemia，簡稱α地貧）是由于α珠蛋白基因缺失（缺失型）或點突變（非缺失型）導(dǎo)致α珠蛋白肽鏈合成減少或缺失而引起的一種溶血性貧血，呈常染色體隱性遺傳。我國最常見的3種缺失型突變?yōu)?-SEA、-α3.7和-α4.2，最常見的3種非缺失型突變?yōu)镠b Constant Spring(Hb CS)、Hb Quong Sze（Hb QS）和Hb Westmead（Hb WS）。血紅蛋白Bart’s水腫胎無法存活，臨床

2、上出生后最為嚴(yán)重的α地貧類型是血紅蛋白H病（Hb H?。?。Hb H病可分為缺失型Hb H病和非缺失型Hb H病，而非缺失型Hb H病的臨床癥狀往往重于缺失型Hb H病。因此在產(chǎn)前診斷中需特別注意避免漏診非缺失型Hb H病。目前血紅蛋白毛細(xì)管電泳技術(shù)能夠篩查Hb CS，但無法篩查Hb QS和Hb WS。對于單純的α地貧點突變攜帶者，臨床上多無癥狀，且血常規(guī)及血紅蛋白分析多無異常，因此在地貧篩查時很容易漏診（除外Hb CS）。在產(chǎn)前篩查時，

3、若夫婦一方為α0地貧，則另一方就有必要進(jìn)行點突變檢測。目前用于檢測非缺失型α地貧的方法主要有反向斑點雜交、等位基因特異性PCR及測序等，但這些方法均存在一定局限性。本研究將高分辨熔解曲線分析技術(shù)（high resolution melting，HRM）用于檢測中國人群常見3種α地貧點突變，并探討其臨床應(yīng)用價值。
　　一、目的
　　應(yīng)用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測中國人群常見3種α地貧點突變：Hb Constant Spring

4、(Hb CS)、Hb Quong Sze（Hb QS）和Hb Westmead（Hb WS），以建立一種簡便快捷、成本低廉、準(zhǔn)確可靠、高通量的分子篩查方法。
　　二、方法
　　1.樣本采集：
　　收集2008年12月至2011年10月基因型已知的α地貧點突變攜帶者樣本81例，均經(jīng)跨越斷裂點聚合酶鏈反應(yīng)（gap-polymerase chain reaction，gap-PCR）、反向點雜交（reverse dot bl

5、ot，RDB）和DNA測序檢測。其中男性34例，女性44例，年齡范圍為4天-50歲，另外還包括3例產(chǎn)前診斷樣本（羊水、絨毛、臍血各1例）。另收集2011年6月至2011年9月的正常健康人樣本14例，其中男性5例，女性9例，年齡范圍為22歲-48歲。正常對照樣本經(jīng)測序驗證不含α(α1和α2)珠蛋白基因點突變。所有樣本均來自廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心。
　　2. PCR擴增：
　　采用LightScanner Prime

6、r Design軟件（美國Idaho Technology公司）設(shè)計1對引物同時擴增α1和α2珠蛋白基因第3外顯子，擴增區(qū)域覆蓋Hb CS、Hb QS和Hb WS點突變。建立并優(yōu)化PCR反應(yīng)體系。
　　3. HRM分析：
　　PCR擴增完成后采用LightScanner96（美國Idaho Technology公司）進(jìn)行HRM分析，應(yīng)用LightScanner Software with Call-IT2.0軟件分析結(jié)果。<

7、br>　　三、結(jié)果
　　經(jīng)HRM分析顯示出5種類型的熔解曲線：（1）Hb QS（αQSα/αα）；（2）Hb QS合并--SEA或-α4.2（αQSα/--SEA、αQSα/-α4.2）；（3）Hb CS及Hb CS合并缺失型突變（αCSα/αα、αCSα/--SEA、αCSα/-α4.2、αCSα/-α3.7）；（4）Hb WS及Hb WS合并--SEA或-α3.7（αWSα/αα，αWSα/--SEA，αWSα/--α3.7）

8、；（5）健康對照組（αα/αα）。所有α地貧點突變樣本均可與正常對照正確區(qū)分，且Hb QS與Hb QS合并缺失型突變可相互區(qū)分。采用HRM篩查Hb CS、Hb QS及Hb WS的靈敏度和特異性為100％。
　　四、結(jié)論
　　HRM分析技術(shù)是一種簡單、準(zhǔn)確、快速、高通量、低成本的遺傳學(xué)分析方法，可作為中國人群常見三種α地貧點突變篩查的優(yōu)選方法。
　　摘要2
　　β地中海貧血（β-thalassemia，簡稱β地貧）

9、是世界范圍內(nèi)最常見的單基因疾病之一，是由β珠蛋白基因（hemoglobin beta，HBB）突變導(dǎo)致β珠蛋白合成障礙而引起的一種溶血性貧血，呈常染色體隱性遺傳。至今已發(fā)現(xiàn)200多種β地貧突變，其中CDs41-42-TCTT、IVS2-654C>T、-28A>G、CD17A>T及CDs71-72+A五種突變占所有突變類型的90%以上。重型β地貧患兒出生后需要定期輸血治療，除非實施造血干細(xì)胞移植成功，大部分患兒將于青少年夭折。由于目前對該

10、病尚無理想的根治方法，因此通過產(chǎn)前診斷阻止重癥患兒出生是防治β地貧的首選措施。目前國內(nèi)外檢測β地貧基因突變的方法主要有等位基因特異性PCR、反向點雜交、變性高效液相色譜等。本研究應(yīng)用高分辨熔解曲線（High Resolution Melting，HRM）分析技術(shù)檢測中國人群常見β地貧突變，并探討其臨床應(yīng)用價值。
　　一、目的
　　應(yīng)用高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測中國人常見β地貧基因突變，以建立一種簡便快捷、成本低廉、準(zhǔn)確可靠、

11、高通量的分子篩查方法。并探討該方法在β地貧產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值。
　　二、方法
　　1.樣本采集：收集廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心30對β地中海貧血高危夫婦及其產(chǎn)前診斷胎兒的DNA樣本，其基因型已經(jīng)過反向點雜交及測序鑒定，均為已知，共包括11種常見的β地貧突變：-29A>G，-28A>G，CDs14-15+G，CD17A>T，CD26G>A，CDs27-28+C，IVS1-1G>T，CDs41-42-TCTT，CD43

12、G>T，CDs71-72+A，IVS2-654C>T。30例產(chǎn)前診斷樣本中包括絨毛13例、羊水16例、臍血1例。另收集3例正常對照樣本，且經(jīng)測序驗證不含HBB基因突變。
　　2. PCR擴增：采用LightScanner Primer Design軟件設(shè)計4對引物分別擴增HBB基因的第1、2外顯子及第2內(nèi)含子部分區(qū)域（涵蓋IVS2-654C>T突變），建立并優(yōu)化PCR反應(yīng)體系。
　　3. HRM分析：PCR擴增完成后采用Li

13、ghtScanner96（美國Idaho Technology公司）進(jìn)行HRM分析，應(yīng)用LightScanner Software with Call-IT2.0軟件分析結(jié)果。
　　三、結(jié)果
　　胎兒的基因型通過與其父母（陽性對照）及正常對照的熔解曲線相比對進(jìn)行鑒定。這30例胎兒中，10例診斷為重型β地貧患者，11例診斷為輕型β地貧攜帶者，9例診斷為正常。在本研究中，HRM分析與RDB及DNA測序結(jié)果的完全一致，未出現(xiàn)假陽性