地中海貧血基因檢測在臨床診斷上的應用

1、地中海貧血基因檢測在臨床診斷上的應用,地中海貧血,地中海貧血，又稱海洋性貧血，是一種常見的單基因遺傳性溶血性血液疾病。廣泛分布在全世界沿海地區(qū)。中國常見于東南沿海、西南 地區(qū)以及臺灣地區(qū)。,地中海貧血的分布,地中海貧血是全球最大的單基因遺傳病之一,地中海貧血,地中海貧血的共同特點是由于珠蛋白基因的缺陷使血紅蛋白中的珠蛋白肽鏈有一種或幾種合成減少或不能合成，致使血紅蛋白的組成成分改變。地中海貧血分為α-地中海貧血和β

2、-地中海貧血。,,α-地中海貧血,α-地中海貧血（簡稱α-地貧）是一種由于α-珠蛋白基因突變導致肽鏈表達失衡而產(chǎn)生的單基因遺傳血液病。多由α-珠蛋白基因的缺失突變所致。研究發(fā)現(xiàn)中國地區(qū)常見的3種 α-地貧主要由 --SEA、-α3.7、 -α4.2缺失(左缺失）引起。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,-50kb -10kb

3、 0kb 10kb 20kb 30kb,(--SEA) Deletion (- ? 4.2) Deletion (- ? 3.7) Deletion,,,?2 ?1,導致α地貧的不同類型的基因缺失,非缺失型α-地貧,概念： α基因發(fā)生點突變或少數(shù)幾個堿基的缺失。中國常見的非缺失型突變：

4、Hb CS ?2 CD 142 TAA?CAA (Gln) Terminator mutation Hb QS ?2 CD 125 CTG?CCG (Leu?Pro) Unstable HbHb WS ?2 CD 122 CAC?CAG (His?Gln) Unstable Hb特點： 常發(fā)生于α2基因，比缺失型導致更嚴重的α珠蛋白鏈合成的減少。,?-地中海貧血,?-

5、地中海貧血是一種由于?-珠蛋白基因突變導致肽鏈合成減少或缺乏而產(chǎn)生的單基因遺傳血液病，多由?-珠蛋白基因點突變所致。 在中國人群中常見的突變位點有CD41-42M， -28M， IVS-II-654M，CD71-72M等,?-地中海貧血突變類型,編碼區(qū)的移碼突變、無義突變和起始密碼突變：如CD41-42，CD71-72 ，CD17突變后形成終止子，表現(xiàn)為?0。 非編碼區(qū)IVS-1和IVS-2突變?nèi)鏘VS-II-654突

6、變影響mRNA的拼接，表現(xiàn)為?＋。影響轉(zhuǎn)錄的突變：如-28，-29的突變影響基因的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為?＋ 。,世界上不同種族的常見β地貧突變類型,,種 族 突變類型,,,地中海人 IVS-1, position 110 (G ? A) CD39, nonsense (CAG ? TAG)

7、 IVS-1, position 1 (G ? A) IVS-2, position 745 (C? G) IVS-1, position 6 (T? C)

8、 IVS-2, position 1 (G ? A)黑人 ?29, (A ? G); ?88, (C ? T) Poly(A), (AATAAA ? AACAAA),東南亞人,中國人 CD 41-42, Frameshi

9、ft (?CTTT) IVS-2, position 654 (C ? T) ?28, (A? G); Hb E (G ? A)

10、 CD17, nonsense (AAG ? TAG) IVS-1, position 5 (G ? C)亞洲印地安人 IVS-1, position 5 (G ? C) CD 8-9, Frameshift

11、(+G) IVS-1, position 1 (G ? T) CD 41-42, Frameshift (?CTTT),世界上不同種族的常見β地貧突變類型,,,種 族 突變類型,珠海,韶關(guān),廣州,汕頭,湛江,廣東省五個地區(qū)地中海貧血遺傳流行病學調(diào)查,西

12、,南,東,北,中,Journal of Clinical Pathology, 2004; 57(5):517-22.,中國南方地中海貧血人群攜帶率,Xu, et al. J Clin Pathol 2004, 57:517-22. Cai, et al. Chi J Epidemiol 2002,23:281-5.,廣東省人群中?地貧的攜帶者頻率,廣東省人群中?地貧的攜帶者頻率,,地貧是嚴重致死、致殘性遺傳性血液病,? 常染色體隱

13、性遺傳病? 受累基因： ?地貧 - ?珠蛋白基因（16p13.3） β地貧 - β珠蛋白基因（11p15.3）? 突變純合子：重型地貧 - 致死 中間型地貧 - 致殘? 病理學基礎：? /β鏈比例失衡,人類不同時期血紅蛋白的組成,胚胎期血紅蛋白：Hb Gower 1 （x2 e2 ）Hb Gower 2 (a2 e2)Hb Portland (x2 g2) 即H

14、b Portland 1另有少量Hb Portland 2 (x2 b2)，Hb Portland 3 (x2 d2)胎兒期主要血紅蛋白：HbF （a2 g2 ） 成人主要血紅蛋白：HbA （ a2 b2）約占血紅蛋白總量96.5—97.5%HbA2 （a2 d2 ） 約占血紅蛋白總量2.5—3.5%HbF （ a2 g2）約占血紅蛋白總量1%以下。,血紅蛋白分子示意圖,地貧純合子：致死性出生缺陷,重型?地貧:胎兒水腫綜合

15、征 ? 早產(chǎn)死胎或出生前后死亡 ? 可導致嚴重產(chǎn)科并發(fā)癥 ? 無理想治療方法,重型?地貧 ? 出生后1年內(nèi)發(fā)病 ? 多于未成年前因嚴重貧血而夭折 ? 輸血和去鐵治療可維持,代價昂貴,地中海貧血的臨床特征,小細胞低色素性溶血型貧血(中、重度)黃疸肝脾腫大 (脾大明顯)骨髓擴增發(fā)育遲緩合并感染Bart’s 水腫胎(α地貧,宮內(nèi)或出生后半小時內(nèi)死亡),地中海貧血的血液學表型特征 ? RBC 參數(shù)

16、 MCV ? MCH ? 細胞形態(tài)變化 ? Hb電泳分析 Hb A2 ? (?) 或 ? (?) Hb Bart’s Hb H (?) Hb E (?),a地貧的基因型與表現(xiàn)型,正常,靜止型－單一α基因缺失或喪失功能 臨床無任何癥狀，一般血液學檢查無異樣，僅平均紅細胞體積(MCV) 位于正常值下限。,a地貧的基因型與表現(xiàn)型,血紅蛋白H病－3個α基因缺失或喪失功能

17、肝脾腫大，中度貧血。小細胞，低色素，HbH含 量較高，易發(fā)生溶血，有些病例需不定期輸血， 癥重者甚至需切除脾臟。,標準型－2個α基因缺失或喪失功能臨床無癥狀，血液學檢查出現(xiàn)輕微貧血，紅細胞大小不均一，平均紅細胞體積(MCV) 及平均血紅蛋白含量(MCH)明顯偏低。,a地貧的基因型與表現(xiàn)型,Hb Bart’s 水腫胎兒綜合癥 4個?基因缺失或喪失功能患胎于妊娠晚期或產(chǎn)后數(shù)小時內(nèi)死亡，全身水腫，肝脾腫大。由于胎兒無法合

18、成?亞基，臍血血紅蛋白（ Hb Bart’s ，?4）含量高。,a2a1T< a2- < - a1<a2Ta1< -a1T < - -,a地貧疾病嚴重程度的單倍型順序,?地貧的基因型與表現(xiàn)型,重型?-地中海貧血所有患者有組織缺氧癥狀，可出現(xiàn)“地中海貧血面容”，生長發(fā)育遲緩。紅細胞體積小且低色素。過剩的游離α鏈形成α鏈包涵體，引起溶血性貧血，靠輸血維持生命。,?＋/ ?＋、?0/ ?0 、?0/ ?＋（純

19、合子或雙重雜合子）,輕型?-地中海貧血患者癥狀較輕，輕度貧血，輕度肝脾腫大。紅細胞脆性降低，小細胞，低色素，MCV、MCH較低。,?A/ ?＋、?A/ ?0 （雜合子）,,中間型?-地中海貧血患者臨床癥狀介于重型和輕型之間，如中度偏重貧血，生長發(fā)育遲緩，黃疸等。血液檢查呈小細胞低色素貧血癥。,?＋/ ?＋、?＋/ ?0 （純合子或雙重雜合子）,?地貧的基因型與表現(xiàn)型,中國南方高發(fā)區(qū)的主要突變類型,根據(jù)?-地貧基因缺失特點，利用多

20、重GAP-PCR技術(shù)可同管檢測三種缺失型及正常四種基因型。通過電泳條帶大小來判斷。操作簡便快捷，結(jié)果直觀可靠。,?-地中海貧血基因檢測,?-地中海貧血基因檢測的臨床意義,對?-地中海貧血進行基因確診，結(jié)果準確可靠。同時檢測 --SEA、-?3.7、-?4.23種缺失型可檢出無臨床癥狀的靜止型?-地貧（??/ -?3.7、 ?? /-?4.2）應用：婚前檢查、產(chǎn)前檢查及產(chǎn)前診斷。,? -地中海貧血基因診斷操作流程,?-地中海貧

21、血基因診斷,M DNA Marker1. (?? /?? ) 1.8kb2. (?? / -? 4.2) 1.8kb; 1.6kb3. (?? / -? 3.7) 2.0kb; 1.8kb4. (-? 4.2 / --SEA ) 1.6kb; 1.3kb 5. (-? 3.7 / --SEA ) 2.0kb; 1.3kb6

22、. (??/--SEA ) 1.8kb; 1.3kb,M 1 2 3 4 5 6 M,? -珠蛋白基因型PCR產(chǎn)物片段長度-? 3.72.0kb?? 1.8kb -? 4.21.6kb--SEA1.3kb,臨床報告單－－樣式,?-地中海貧血點突變基因檢測,同時檢測 ? CS、 ? QS、 ? WS點突變,Wild typeCSMWSMQSM,臨床意

23、義： 作為 ? -地中海貧血三種缺失型的補充，對懷疑? -地中海貧血有漏診的患者進行? CS、 ? QS、 ? WS點突變的診斷，確定具體的基因突變類型,β-地中海貧血基因診斷,可對17個突變位點 (8個常見位點及9個少見位點)進行檢測 合理的探針設計明顯減少了非特異性雜交反應的發(fā)生位點設計更合理，絕大部分突變位點都有相應正常對照，結(jié)果易于判定,β-地中海貧血基因診斷操作流程,β-地中海貧血基因診斷結(jié)果判讀,,654