反向點(diǎn)雜交快速診斷非缺失型α-地中海貧血.pdf

1、目的:建立一種簡(jiǎn)便快速的篩查中國(guó)人非缺失型α-地中海貧血點(diǎn)突變的反向點(diǎn)雜交(reverse dot blot,RDB)技術(shù),使之可以應(yīng)用于臨床診斷及大人群篩查工作中.方法:1.標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品準(zhǔn)備及罕見突變樣品的構(gòu)建:DNA的抽提按經(jīng)典的酚-氯仿抽提法,DNA樣品經(jīng)測(cè)序確定基因型作為該實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)樣品.罕見突變樣品α<'CD30>α,α<'CD59>α和α<'WS>α的構(gòu)建是通過基于PCR設(shè)計(jì)的人工致突變反應(yīng)體系從野生型櫚中制備所需點(diǎn)突變的

2、目的基因,再運(yùn)用經(jīng)典的基因工程技術(shù)將誘變得到的目的基因進(jìn)行克隆并測(cè)序鑒定.2.RDB膜條的制備:設(shè)計(jì)、合成寡核苷酸探針,5'端加-NH<,3>標(biāo)記.膜條的制備由該實(shí)驗(yàn)室完成.3.PCR選擇性擴(kuò)增人α2珠蛋白基因:合成特異性擴(kuò)增α2珠蛋白基因的引物C1、C3,將生物素直接標(biāo)記在引物5'端上.以DNA樣品及誘變成功的質(zhì)粒為模板,用這一對(duì)引物可以選擇性地壙增出一長(zhǎng)1,085bp的α2珠蛋白基因,包含了中國(guó)人已發(fā)現(xiàn)的6種非缺失型α-地貧的突變位