α珠蛋白基因拷貝數(shù)變異的檢測及快速診斷常見中國人缺失型α-地中海貧血.pdf

1、一、α珠蛋白基因拷貝數(shù)變異的檢測方法研究
　　 拷貝數(shù)變異(Copynumbervariants，CNVs)是一種重要的結(jié)構(gòu)變異，可通過改變基因的劑量或影響基因表達來改變表型或?qū)е录膊?。CNV在人類基因組中的分布非常普遍，可影響基因組中超過10％的序列。然而受限于檢測手段，這類遺傳變異直到最近幾年才為研究者所重視并迅速成為當前人類遺傳學(xué)研究的熱點。
　　 以我們熟悉的α珠蛋白基因為例，可以看到該基因的拷貝數(shù)變異與α地中海

2、貧血（簡稱α地貧）的臨床表型間存在密切聯(lián)系。正常個體中存在4個α珠蛋白基因。當1～4個α珠蛋白基因相繼發(fā)生缺失時，可分別導(dǎo)致以下幾種不同的臨床表型:其中1個基因缺失時為“靜止型”，沒有可檢測的臨床癥狀，無明顯血液學(xué)改變;2個基因缺失時為“標準型”，表現(xiàn)為典型的小細胞、低色素性貧血;3個基因缺失時為“中間型”，表現(xiàn)為血紅蛋白病即HbH病，有明顯的甚至嚴重的貧血癥狀，患兒從1歲左右即出現(xiàn)貧血，嚴重者肝脾腫大及黃疸，面黃肌瘦并伴骨骼變化，靠輸

3、血維持生命;4個基因都缺失時為“重型”，表現(xiàn)為致死性巴氏水腫胎綜合癥，是最嚴重的一種，生下來就是死胎或很快就死亡。除缺失外，α珠蛋白基因的重復(fù)會產(chǎn)生5個拷貝的α珠蛋白基因(αααanti3.7/αα或αααanti4.2/αα)，這一額外的α珠蛋白基因會導(dǎo)致β地貧患者的臨床癥狀加重。我們通過對α珠蛋白基因拷貝數(shù)的定量來確定基因型，直接篩查出地中海貧血的高危人群。不僅如此，還可以α珠蛋白基因為模型，探索出一種適用于其它靶基因位點拷貝數(shù)檢測

4、的通用方法，以滿足目前對CNV-疾病間關(guān)系研究的需要。
　　 近年來，多種基于芯片的高通量方法用于識別全基因范圍內(nèi)的CNV，如芯片比較基因組雜交（Arraycomparativegenomichybridization，ArrayCGH）、SNP分型芯片(SNPgenotypingarrays)以及深度測序方法(Deepsequencing-basedapproaches)。這些方法具有較高的分辨率，主要應(yīng)用于全基因組范圍CNV

5、圖譜的構(gòu)建和疾病的關(guān)聯(lián)分析，但并不適用于診斷針對某種疾病的特定基因位點的拷貝數(shù)變異。而針對靶基因位點CNV的檢測方法有以下幾種:多重可擴增探針雜交(Multiplexamplifiableprobehybridization，MAPH)，多重連接探針擴增(Multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA)，短熒光片段多重定量PCR(QuantitativemultiplexPCRofs

6、hortfluorescentfragments,QMPSF)以及實時熒光定量PCR(Real-timequantitativePCR)。作為篩查和診斷的目的，這幾種方法都存在各自的優(yōu)缺點。以目前應(yīng)用較廣泛的MLPA方法為例，該方法高效、特異，在一次反應(yīng)中可以同時檢測40多個靶序列拷貝數(shù)的改變。不足之處在于:1、開放式檢測平臺，容易造成污染;2、其設(shè)計的長探針不能通過普通的化學(xué)方法合成，需要通過M13載體克隆的方法獲得;3、雜交步驟耗時

7、過長（約16小時）。這些都限制了其作為分子篩查方法的推廣和應(yīng)用。
　　 實時熒光定量PCR是比較受歡迎的檢測平臺，因為操作簡便，快速高效，具有很高的敏感性和特異性;其次，是在封閉的體系中完成擴增并進行實時測定，有效的避免污染，而且直接檢測結(jié)果，無需擴增后操作;另外，多熒光通道允許在同一反應(yīng)體系中同時對多個靶序列進行擴增。該方法已廣泛應(yīng)用于針對特定位點進行拷貝數(shù)定量，對已知的CNV進行確認。但是多重PCR本身存在一些問題。如不同引

8、物對之間的錯配擴增，不同靶序列擴增效率不一致導(dǎo)致效率低的靶點被擴增效率較高的靶點所抑制，這些都會影響拷貝數(shù)定量分析。
　　 為了更好的利用實時定量PCR的優(yōu)勢，同時又避免多重PCR擴增效率不一致的缺點，我們建立了一種基于多重加尾引物擴增的巢式實時熒光定量PCR的新方法。我們選擇α珠蛋白基因作為建立該方法的候選基因。該方法的建立，有助于在人群中大規(guī)模篩查α珠蛋白基因的重復(fù)和缺失，建立一種可靠的分子篩查方法。在此基礎(chǔ)上，有望成為一種

9、適用于其它疾病相關(guān)的CNV進行快速分型的通用方法。
　　 本方法的研究原理是針對特異位點序列設(shè)計加尾引物，包括上游引物和下游引物。經(jīng)過有限循環(huán)的擴增后，擴增產(chǎn)物包含完整的基因組短片段序列及加尾序列。這樣就將位點的起始拷貝數(shù)等比例轉(zhuǎn)化為可供擴增的加尾產(chǎn)物的數(shù)目。然后加入通用引物及熒光檢測探針，對不同位點的加尾產(chǎn)物同時擴增并記錄熒光曲線Cq值。本研究將涉及到上述拷貝數(shù)變異的α1珠蛋白基因（簡稱α1）和α2珠蛋白基因（簡稱α2）作為待

10、檢基因，看家基因β-actin作為參考基因，將已知基因型的正?；蚪M樣本作為標準品，對待檢基因的拷貝數(shù)進行相對定量。將參考基因作為內(nèi)標，標準品作為外標，對未知樣品待測基因位點的Cq值進行雙重標化，獲得基因拷貝數(shù)數(shù)值。反應(yīng)體系中總共包括三種引物及探針，分別為識別特異位點序列的加尾引物、通用引物與雙標記的TaqMan探針。加尾引物由三個部分組成:特異位點的基因組序列、通用引物序列以及熒光標簽序列，其中后兩者的序列與人類基因組序列無關(guān)，是自行

11、設(shè)計的寡核苷酸序列組合。每個加尾序列包含各自特異的22～23bp隨機組合的熒光標簽序列，用于結(jié)合不同熒光標記的檢測探針，以通過不同熒光通道的擴增曲線將不同的待檢基因區(qū)分開來。
　　 本研究擬建立的拷貝數(shù)定量方法是建立在不同位點均一擴增的基礎(chǔ)上，所以在進行拷貝數(shù)計算之前，首先要評估不同位點的擴增效率是否一致。在效率一致的前提下，才能得出的可靠拷貝數(shù)定量結(jié)果。結(jié)果顯示，在同一個反應(yīng)體系中，α1、α2及β-actin的擴增效率分別為9

12、9.1％、98.2％及100.3％。用模板的稀釋倍數(shù)的log值對每個稀釋樣品的目標基因與參考基因的Cq值之差△Cq(Cq目標基因—Cq參考基因)作圖，用最小方差線性回歸法進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示兩個待檢基因α1和α2相對于參考基因β-actin的△Cq曲線斜率分別為0.019，0.029，接近于0，可認為待檢基因與參考基因的效率一致。
　　 為評價本方法的檢測靈敏度，我們將已知濃度(60.0ng)的正常基因型αα/αα樣本進行2倍

13、倍比稀釋，用稀釋后不同濃度(3.25ng～60.0ng)的模板進行擴增反應(yīng)，獲得Cq值后，計算不同濃度樣本α1和α2的拷貝數(shù)比值。當濃度低至3.25ng/μL時，本的α1和α2拷貝數(shù)比值與實際的基因型相符。其他5種基因型樣本在此濃度下，得到的α1和α2拷貝數(shù)比值與基因型相符合。說明本方法的檢測靈敏度至少可以達到3.25ng/μL。
　　 為檢驗方法的重復(fù)性，我們選取αα/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα

14、、--SEA/-α3.7、--SEA/-α4.2、-α3.7/-α3.7、-α4.2/-α4.2、-SEA/-SEA、αααanti3.7/αα、-α3.7/αααanti4.2這11種代表性基因型樣本各2例，每例樣本重復(fù)5次，對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計，考察本方法檢測的重復(fù)性。實驗結(jié)果得出的標準差SD為0.00～0.16，并且不同拷貝數(shù)(0～3copies)α1/α2之間的拷貝數(shù)比值在95％可信區(qū)間范圍內(nèi)沒有重疊，單因素方差分析統(tǒng)計結(jié)果具有顯

15、著差異。另外，3拷貝與2拷貝的待檢基因樣本在拷貝數(shù)上是1.5倍的差異，而在Cq值上僅相差0.585個循環(huán)，這種差異對于普通的多重?zé)晒舛縋CR方法來說，是比較難區(qū)分出的。本方法顯示3拷貝基因型樣本（包括αααanti3.7/αα及-α3.7/αααanti4.2）與正常2拷貝樣本之間能有效的區(qū)分開。
　　 最后，我們還評價了本方法的特異性。我們選取了中國人16種不同的缺失型α-地中海貧血共95例基因組樣本作為模板，進行反應(yīng)。從結(jié)

16、果上看，我們得到待檢基因的實測拷貝數(shù)比值與樣本已知的基因型相比較，符合率為100％，并且不同基因拷貝數(shù)之間的拷貝數(shù)比值沒有重疊。
　　 本方法的創(chuàng)新之處在于:1、將待檢基因的起始拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化為可供擴增的加尾產(chǎn)物的數(shù)量，通過一對通用引物對不同位點進行均一擴增，避免了直接擴增基因組序列所造成的效率不一致問題。2、將隨機22～23bp的寡核苷酸序列作為“熒光標簽”，與相應(yīng)熒光標記的檢測探針結(jié)合后，在具有5’外切酶功能的聚合酶作用下，釋放

17、熒光信號。每個待檢基因加尾引物包含各自特異的“熒光標簽”，通過不同的熒光通道擴增曲線的Cq值來區(qū)分待檢基因。本研究中使用的“熒光標簽”不僅用于檢測α1和α2，同樣適用于其它疾病相關(guān)的待檢基因，使本方法具備了通用的特征。3、通過有限循環(huán)的PCR預(yù)擴增獲得完整的基因組短片段序列，達到與MLPA方法中雜交過夜后再連接相似的效果，然而我們的方法大大縮短了反應(yīng)時間，減少了反應(yīng)步驟。
　　 本研究以α珠蛋白基因為模型，建立了一種針對疾病相關(guān)

18、靶基因拷貝數(shù)變異進行相對定量的新方法。我們通過α1/α2的拷貝數(shù)定量，即可對中國人常見缺失型地貧進行篩查和診斷。本方法還可檢測出三拷貝的α珠蛋白基因，這樣我們一方面可應(yīng)用該方法進行大規(guī)模人群篩查以獲得完整的中國人群中三聯(lián)體的分布頻率數(shù)據(jù)，另一方面，三聯(lián)體的檢出有助于對中間型β地貧患者提供更準確的基因診斷和遺傳咨詢。在此基礎(chǔ)上，我們還可將本方法推廣到其它致病基因拷貝數(shù)變異的快速分型和診斷的應(yīng)用中。
　　 二、快速診斷常見中國人缺失

19、型α-地中海貧血的方法學(xué)研究
　　 α-地貧是世界上最常見的單基因遺傳病，也是我國南方各省最常見、危害最大的遺傳病。本病是由于第16號染色體短臂末端α-珠蛋白基因缺陷所致，分為缺失型和非缺失型兩種，其中缺失型是主要類型。在廣東人群中，超過96％的α-地中海貧血是由東南亞缺失（--SEA）、左側(cè)缺失(-α4.2)和右側(cè)缺失（-α3.7）引起。本病尚無有效治療方法，攜帶者篩查及產(chǎn)前基因診斷是唯一防止新的患兒出生、提高人口素質(zhì)的有效措

20、施。目前，多種分子診斷技術(shù)已用于α-地中海貧血的診斷檢測。其中多重Gap-PCR已廣泛用于α-地中海貧血的分子篩查和臨床診斷，但該方法使用凝膠電泳進行結(jié)果分析，一方面容易造成污染，另一方面檢測通量也受到限制。目前，實時定量PCR已廣泛應(yīng)用于臨床實驗室，該平臺是在封閉系統(tǒng)中進行反應(yīng)，且無需擴增后操作，直接檢測結(jié)果，能有效避免污染，且通量較高。因此，本研究擬建立一種基于實時熒光定量平臺的，具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性高的診斷方法，以快速診斷出中國人

21、中常見的三種缺失型α-地中海貧血。
　　 本方法是一種基于多重探針連接反應(yīng)的巢式實時熒光定量PCR技術(shù)，通過連接酶反應(yīng)獲得完整的待檢基因序列，同時通用引物序列和熒光標簽也被加入到產(chǎn)物中，以實現(xiàn)不同待檢基因一致擴增的效果。使我們在一個反應(yīng)管中，可以同時檢測出三種常見的缺失類型。
　　 本研究的設(shè)計原理是針對待檢基因序列設(shè)計若干對寡核苷酸連接探針，每對連接探針分為左側(cè)探針和右側(cè)探針，分別位于待檢基因序列的相鄰部位。當探針與基

22、因組DNA模板結(jié)合后，通過連接酶的連接反應(yīng)，將左側(cè)和右側(cè)探針連接，形成一條可供擴增的完整的連接產(chǎn)物。這樣就將待檢基因的起始拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化為可供擴增的連接產(chǎn)物的數(shù)目。所有待檢基因的左側(cè)探針和右側(cè)探針上都含有相同的通用引物結(jié)合位點，這樣我們可以通過一對引物即可同時擴增不同的連接探針。且不同待檢基因的左側(cè)探針上有一段獨特的“熒光標簽”，用于結(jié)合熒光檢測探針，經(jīng)實時熒光定量PCR反應(yīng)后，不同熒光基團標記的檢測探針可以指示不同的可供擴增的連接產(chǎn)物數(shù)量

23、，即間接指示了對應(yīng)基因的拷貝數(shù)。并且利用外切酶I切割單鏈的效應(yīng)，將連接反應(yīng)中過量的連接探針水解掉，降低熒光定量的背景干擾。我們獲得代表不同待檢基因的熒光曲線Cq值，用參考基因及標準品進行標化后，即可獲知待檢基因的拷貝數(shù)情況，判斷是否有缺失。
　　 我們考察了多個反應(yīng)因素對連接反應(yīng)體系和實時熒光PCR檢測體系的影響，確定了各因素的最佳反應(yīng)條件。在重復(fù)性試驗中，我們以3例缺失型樣本及1例正常對照樣本為模板，每個樣本重復(fù)5次實驗，采集

24、拷貝數(shù)定量數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SD值為0.04～0.12，CV為3.64～16.46％，拷貝數(shù)范圍區(qū)間沒有重疊，具有良好的可重復(fù)性和區(qū)分能力。
　　 與MLPA方法相比，本方法最顯著的優(yōu)點之一就是連接探針完全采用化學(xué)合成的方法獲得。MLPA技術(shù)中的右側(cè)雜交探針有一段“barcode序列”，不同探針的“barcode序列”長度不同，擴增后通過毛細管電泳來檢測PCR產(chǎn)物的長度，從而得出相關(guān)探針對應(yīng)位點的拷貝數(shù)。這使得右側(cè)雜交

25、探針長度由80bp～400bp不等，如此長的探針無法通過普通的化學(xué)方法進行合成，只能采用M13噬菌體克隆獲得。由于雜交探針數(shù)目眾多，這就決定了這項工作的繁瑣性，不利于這項技術(shù)的應(yīng)用和推廣。本方法將原先的“barcode序列”變?yōu)椤盁晒鈽撕灐?，由依靠雜交探針長度區(qū)分變?yōu)橐揽繖z測探針區(qū)分。這樣所有的單個連接探針長度都不超過70bp，完全可以采用化學(xué)合成的方法獲得，大大節(jié)省了人力和物力，保證了探針合成的數(shù)量和質(zhì)量，并且有利于這項技術(shù)的推廣應(yīng)用

26、。
　　 在MLPA中，僅雜交過程就需要16小時，主要是因為其使用的探針長度過長，且為了減少未反應(yīng)的探針濃度，使用較低濃度的雜交探針(10pmol)，這兩種因素導(dǎo)致雜交反應(yīng)時間過長。在本研究中，我們設(shè)計連接探針均為短片段，其采用相對高濃度（1.0nmol），大大超過模板DNA的濃度，30分鐘即可完成快速高效連接。大大縮短了操作時間，這對臨床診斷無疑具有重要的意義。
　　 本研究依靠連接探針上檢測序列的不同區(qū)分不同目的基因