華南地區(qū)中間型β地中海貧血的分子基礎(chǔ)：遺傳異質(zhì)性和表型多樣性.pdf

1、背景與目的： 本研究立足于地貧的高發(fā)區(qū)收集中間型β地中海貧血樣本，系統(tǒng)分析來自華南地區(qū)的117例中間型β地貧患者的分子基礎(chǔ)，研究靶點(diǎn)包括β珠蛋白基因型，α珠蛋白基因型和其他影響α/β珠蛋白基因比例的一些遺傳修飾因素。本研究擬通過對中間型β地貧患者的臨床資料，血液學(xué)資料和分子基礎(chǔ)進(jìn)行綜合分析，闡明華南地區(qū)的中間型β地貧的分子基礎(chǔ)，為臨床實(shí)踐提供必要的支持。 病例樣本與方法： 1.病例樣本及表型分析： 納入本

2、研究的樣本來自地中海貧血高發(fā)區(qū)（主要是廣西省和廣東省）的109個(gè)家系，共117例中間型β地貧患者（納入標(biāo)準(zhǔn)：Hb含量在60～105 g/L；MCV<80 fL； MCH<27 pg；在幼兒期間可以不依賴輸血而能夠存活；發(fā)病年齡在2歲以后）。統(tǒng)計(jì)樣本的輸血情況，首次發(fā)病時(shí)的年齡，肝脾是否腫大，有無進(jìn)行脾切除手術(shù)，有無地貧面容等。采集117例樣本的EDTA抗凝外周靜脈血。 2.實(shí)驗(yàn)方法： （1）對117例樣本進(jìn)行如下分析：①

3、進(jìn)行血常規(guī)和血紅蛋白含量分析，提取所有樣本的DNA，-20℃低溫保存?zhèn)溆?。②對α、β珠蛋白基因的突變進(jìn)行分析：利用反向點(diǎn)雜交技術(shù)（reverse dot blot，RDB）對中國人群中常見的α、β珠蛋白基因點(diǎn)突變或小的缺失或插入突變進(jìn)行分析；利用Gap-PCR技術(shù)分析中國常見的珠蛋白基因缺失突變（3種常見的α珠蛋白基因缺失突變，包括-α3.7、-α4.2和——SEA。2種β珠蛋白基因簇缺失，包括東南亞型遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白綜合征（S

4、EA-HPHF）缺失和中國型Gγ+（Aγδβ）0缺失）；利用PCR技術(shù)對αααanti3.7和αααanti4.2這兩種α珠蛋白基因的三聯(lián)體進(jìn)行分析。③利用基于PCR基礎(chǔ)上的Xmn1酶切技術(shù)，分析Gγ珠蛋白基因的-158位的Xmn1酶切位點(diǎn)。經(jīng)過上述分析，117例樣本可以分為兩類，一類是基因型可以解釋表型的樣本；一類是基因型尚不能解釋表型的樣本（β0/β0，β+/βN或β0/βN） （2）對基因型為β0/β0，β+/βN或β0/

5、βN的樣本進(jìn)一步分析。針對前者，PCR擴(kuò)增α2和α1珠蛋白基因全長，對PCR產(chǎn)物直接測序。采用基于PCR基礎(chǔ)上的直接測序技術(shù)進(jìn)一步對多個(gè)可使HbF水平升高的遺傳修飾因素進(jìn)行分析，這些因素包括：3'HS1，5'HS2核心區(qū)，Gγ和Aγ珠蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)，β珠蛋白基因-540區(qū)的（AT）x（T）y序列，BCL11A基因中rs11886868的SNP位點(diǎn)信息。針對后者，對以下多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了分析：β珠蛋白基因全長，5’HS2和5'HS3的核心

6、區(qū)，AHSP基因全長，以及GATA-1和HRI的cDNA序列。對部分樣本5’HS2核心區(qū)的PCR產(chǎn)物通過克隆測序進(jìn)一步驗(yàn)證。 （3）對本課題中可能發(fā)現(xiàn)的新突變進(jìn)行分析：①評價(jià)新突變對β珠蛋白基因表達(dá)水平的影響②利用基于PCR的限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術(shù)對β珠蛋白基因簇進(jìn)行單倍型分析。 （4）利用半變性高效液相色譜（DHPLC）技術(shù)

7、分析新突變和BCL11A基因的SNP位點(diǎn)rs11886868在對照樣本中的情況。 （5）統(tǒng)計(jì)分析：采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0。主要是利用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)方法分析突變對β珠蛋白基因mRNA水平的影響。 結(jié)果與討論： 本研究我們共收集到117例中間型β地貧樣本。年齡介于2歲和60歲，發(fā)病年齡則處于1.5歲和27歲。75例有地貧面容，29例尚未出現(xiàn)地貧面容。62例沒有輸過血，15例輸血1次，31例需要偶爾輸血。69

8、例患者存在肝脾腫大，其中實(shí)行脾切除手術(shù)的患者有23例，36例尚未出現(xiàn)肝脾腫大。可見，這些中間型β地貧患者的表型差別很大，即具有很大的表型異質(zhì)性。 本課題在117例中間型β地貧患者中共檢測到18種β珠蛋白基因突變，這些突變的出現(xiàn)頻率明顯不同，它們的出現(xiàn)頻率從大到小的順序排列如下：一28（A→G），CD41-42（-CTTT），CD17（A→T），βE（CD26 G→A），IVS-2-654（C→T），IVS-2-5（G→C），CD

9、71-72（+A），SEA-HPFH，IVS-1-1（G→T）和-29（A→G），中國型Gγ+（Aγδβ）0，CD43（G→T），-73（A→T）、CD15-16（+G）、CD27-28（+C）、CD53（-T）、Cap+39（C→T）和Term CD+32（A→C）等6種突變各1例，最后兩種突變是在本課題中首次發(fā)現(xiàn)的，相關(guān)信息已經(jīng)提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號分別為FJ876835和FJ876836。除了檢測到上述的β珠蛋白基因突

10、變外，有22例樣本同時(shí)合并α珠蛋白基因突變，共涉及5種α珠蛋白基因突變，其中CD142（T→C）（αCS）2例，-α3.73例，——SEA11例，-α4.21例，6例存在αααanti3.7，未發(fā)現(xiàn)αααanti4.2三聯(lián)體。 18種β珠蛋白基因突變和5種α-珠蛋白基因突變組成了51種β和α珠蛋白基因型組合。根據(jù)β珠蛋白基因型，117例中間型β地貧樣本可以分為兩類：（1）β珠蛋白基因突變純合子或者雙重雜合子，有97例。（2）β珠

11、蛋白基因突變雜合子，有20例。分析表明這兩類患者的主要血液學(xué)指標(biāo)都存在顯著差異（Mann-Whitney test，P<0.05）。在第一類97例中間型β地貧樣本中：（1）α珠蛋白基因正常，β珠蛋白基因突變純合子或雙重雜合子有44例，占總樣本的37.6%（44/117）。（2）α珠蛋白基因正常，HbE合并β0珠蛋白基因突變有27例，占總樣本的23.1%（27/117）。（3）β珠蛋白基因突變純合子或雙重雜合子合并α珠蛋白基因突變15例。

12、我們檢測到2例特殊病例：1例為β珠蛋白基因突變雙重雜合子合并HbH病，基因型具體為βCD17（A→T/βIVS-2-654（C→T）合并——SEA/-α4.2；另一例是β-28（A→G）/β-28（A→G）合并αααanti3.7/αα。（4）7例為β珠蛋白基因突變雜合子合并SEA-HPFH，4例為β+/中國型Gγ+（Aγδβ）0或β0/中國型Gγ+（Aγδβ）0。其中，有兩例樣本的基因型分別是βIVS-2-654（C→T）/中國型Gγ

13、+（Aγδβ）0和β→28（A→G）/中國型Gγ+（Aγδβ）0，此外，這兩例樣本的α珠蛋白基因型均為——SEA/αα。 在第二類20例中間型β地貧樣本中：（1）α珠蛋白基因正常，β珠蛋白基因突變雜合子樣本14例，占12.0%（14/117）。其中，β+/βN樣本1例，具體基因型為β-28（A→G）/βN；其余13例樣本為β0/βN，具體為7例βIVS-2-654（C→T/βN，3例βCD17（A→T）/βN，2例βCD71-7

14、2（+A）/βN，1例為β41-42（-CTTT）/βN。（2）α珠蛋白基因正常，基因型為βCD53（-T）/βN的β珠蛋白基因顯性突變雜合子樣本1例。（3）β珠蛋白基因突變雜合子合并αααanti3.7/αα有5例。 值得注意的是，在117例中間型β地貧樣本中，有14例為β珠蛋白基因突變雜合子，其中1例為β_28（A→G）／βN，7例βIVS-2-654（C→T/βN，3例βCD17（A→T／βN，2例βCD71-72（+A）

15、／βN，1例為β41-42（-CTTT）／βN。 結(jié)論： 1.研究表明華南地區(qū)的中間型β地貧患者具有很大的遺傳異質(zhì)性。117例中間型β地貧樣本的分子基礎(chǔ)可歸結(jié)為兩大類，即20例（占17.1%）β珠蛋白基因突變雜合子和97例（占82.9%）β珠蛋白基因突變純合子或者雙重雜合子。前者又可分為：α珠蛋白基因正常，β珠蛋白基因突變雜合子樣本14例；α珠蛋白基因正常，基因型為βCD53（-T）/βN的β珠蛋白基因顯性突變雜合子樣本

16、1例；β珠蛋白基因突變雜合子合并αααanti3.7／αα5例。后者又包括：α珠蛋白基因正常，β珠蛋白基因突變純合子或雙重雜合子有44例；α珠蛋白基因正常，HbE合并β0珠蛋白基因突變有27例；β珠蛋白基因突變純合子或雙重雜合子合并α珠蛋白基因突變15例；7例為β珠蛋白基因突變雜合子合并SEA-HPFH，4例為β+/中國型Gγ+（Aγδβ）0或β0/中國型Gγ+（Aγδβ）0（其中2例樣本合并——SEA/αα）?？傊?，我們已經(jīng)基本闡明了

17、華南地區(qū)中間型β地貧的分子基礎(chǔ)。 2.在117例中間型β地貧樣本中，有3例β0/β0樣本和14例β珠蛋白基因突變雜合子樣本。針對這些樣本，我們對可導(dǎo)致中間型β地貧的主要及次要遺傳修飾因子進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，但是未能闡明他們的分子基礎(chǔ)，需要進(jìn)一步的研究。 3.發(fā)現(xiàn)了2例新的β珠蛋白基因突變類型，Cap+39（C→T）和Term CD+32（A→C），豐富了人類β珠蛋白基因突變數(shù)據(jù)庫，對臨床具有指導(dǎo)意義。評價(jià)了突變對mRNA水