人β654型地中海貧血突變基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因小鼠的建立.pdf

1、Y766720分類號(hào)：Q789UDC6161551密級(jí)：一般編號(hào)：0211072002幽撼醉碩士學(xué)位論文人D654型地中海貧血突變基詞的克隆及其轉(zhuǎn)基因小鼠的建立學(xué)位申請(qǐng)人盧麗導(dǎo)師姓名及職稱專業(yè)名稱黃冰副教授動(dòng)物學(xué)2005年5月10日作者：盧麗載體上并進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證其序列的正確性。將擴(kuò)增得到的13654基因克隆至包含人BLCR序列的基礎(chǔ)質(zhì)粒上，重組質(zhì)粒經(jīng)BcgI酶切鑒定。21人0654型地中海貧血突變基因轉(zhuǎn)基因小鼠的建立重組質(zhì)粒經(jīng)毖鉀V酶

2、切可獲得長(zhǎng)64kb的目的片段(目的基因包括人13LCR序列及人B654基因)。目的片段回收純化后稀釋至3ng／ul用于顯微注射。使用顯微注射儀將外源DNA注入小鼠受精卵雄原核內(nèi)，經(jīng)轉(zhuǎn)基因操作后的受精卵移植至假孕母鼠體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育。小鼠出生后用PCR法初篩轉(zhuǎn)基因小鼠，PCR產(chǎn)物自動(dòng)測(cè)序；RT—PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)外源基因的表達(dá)：最后，對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血進(jìn)行血紅蛋白的分析，及觀察轉(zhuǎn)基因小鼠有無出現(xiàn)地中海貧血的癥狀。同時(shí)，將轉(zhuǎn)基因小鼠與

3、非轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行交配繁殖，獲得的子代鼠用同樣方法進(jìn)行檢測(cè)。研冤結(jié)果：人B654型地中海貧血突變基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為3314bp，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST驗(yàn)證與基因庫(kù)中序列一致，擴(kuò)增產(chǎn)物包含了該突變基因第二內(nèi)含子中的C—T點(diǎn)突變。引入0654基因后，重組質(zhì)粒長(zhǎng)約92kb，經(jīng)卻I酶切鑒定，產(chǎn)生72kb和2Okb兩種長(zhǎng)度片段，說明t3654基因與基礎(chǔ)質(zhì)粒中原有的人BLCR片段的方向相同。將目的片段以顯微注射法導(dǎo)入昆明小鼠的受精卵，共注射小鼠

4、受精卵219枚，得新生小鼠31只，經(jīng)PCR初篩獲得轉(zhuǎn)基因小鼠2只(首建鼠)。由2只首建鼠繁殖獲得子代小鼠107只，得子代轉(zhuǎn)基因小鼠6只。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中含有引入的C—T點(diǎn)突變。RT—PCR檢測(cè)結(jié)果表明，部分轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血RNA中含有長(zhǎng)303bp的異常剪切片段；而在陰性對(duì)照鼠的外周血RNA中，RT—PCR擴(kuò)增后無產(chǎn)物；說明B654基因已成功整合入轉(zhuǎn)基因小鼠基因組并有轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)基因小鼠血紅蛋白的分析的結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基